科技公园文/李梅
我国是世界第一养猪大国，生猪养殖量占世界总量的一半以上。猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起一种新的世界范围内的重要猪传染病，1997年首次暴发于加拿大，并迅速传播至北美和欧洲国家，生猪发病率40%~50%，死淘率20%以上，造成严重经济损失。2000年该病在我国首次证实，并迅速流行至全国所有省市，每年经济损失估计超过100亿元。
针对我国猪圆环病毒病危害严重、国内外缺乏该病防控措施的突出问题，南京农业大学姜平教授主持的课题组在国家和部省级课题项目资助下，第一时间开展流行病学调查，分离鉴定出免疫原性高的优势流行强毒株，阐明其发病和免疫机制，成功研制出具有自主知识产权、安全性好、免疫效力强和应用成本低的PCV2灭活疫苗。此后，课题组持续创新，发明了PCV2免疫保护多肽分子、高免疫原性VLPs重组蛋白及我国首个猪用水溶性免疫佐剂，联合江苏南农高科技股份有限公司、普莱柯生物工程股份有限公司和中牧实业股份有限公司，合作研究成功6种安全高效的疫苗，为我国该病防控作出了重要贡献。
猪圆环病毒2型灭活疫苗——解决疫病防控关键技术难题
2000年我国首次发现存在PCV2感染。为了弄清该病临床危害情况，课题组深入生猪养殖一线，广泛开展流行病学调查。3年中采集了10个省市476个规模猪场患病猪群病料，开展病原学检测，阐明了我国PCV2感染规律。完成31个PCV2分离毒株的全基因组测序分析，发现我国存在PCV2a向PCV2b的基因漂移和基因重组现象，明确了我国PCV2优势流行毒株为PCV2b基因型。分离获得生物学特性明确的PCV2b基因型SH毒株，成功建立了商品断奶仔猪PMWS发病模型，为疫苗研究奠定了重要疫苗种毒基础。
针对PCV2培养滴度低和疫苗产业化困难等世界性技术难题，课题组采用单细胞克隆技术及荧光定量PCR方法，经过大量筛选和检测，建立了能稳定生产高滴度病毒的PK15-B1克隆细胞系，接种PCV2后出现了常规细胞培养没有的细胞聚集、拉网和脱落等细胞病变，病毒滴度提高100倍以上，创建了我国首个PCV2灭活疫苗生产工艺。同时，成功建立了疫苗效力检验小鼠参考疫苗免疫试验替代方法，有效地解决了实验猪来源困难和免疫攻毒存在散毒风险的技术难题，制定了疫苗制造与检验规程及质量标准，研制成功我国第一个安全高效的猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)，获国家二类新兽药注册证书(证书号(2010)新兽药证字25号)和国家重点产品证书，解决了该病防控的关键性技术难题。
猪圆环病毒2型亚单位疫苗——创新疫苗研发关键技术
基因工程技术表达疫苗抗原技术有助于解决病毒培养困难和疫苗抗原纯度低等技术问题。猪圆环病毒Cap蛋白由60个核衣壳蛋白亚基组装而成，但其关键结构及功能、重要抗原位点不清，存在表达效率不高等技术难题。课题组采用基因工程技术制备获得Cap重组蛋白，发现了穿膜肽可有效促进Cap蛋白呈现可溶性表达，阐明了Cap重组蛋白病毒样颗粒(VLPs)可展示生长抑制激素多肽，热应激蛋白可增强Cap蛋白免疫作用。经过Cap蛋白基因密码子优化和抗原分子设计，成功构建了PCV2重组杆状病毒，Cap蛋白实现高效可溶性表达，并且形成稳定高免疫原性VLPs，诱导小鼠和猪体产生高水平PCV2特异抗体和细胞免疫应答反应，为PCV2疫苗研制提供了关键性材料。
免疫佐剂是制备灭活疫苗的重要组成成份，但我国猪用疫苗长期依赖进口免疫佐剂。课题组研究了Toll样受体的激动剂、细胞因子IL17、细菌脂质体和核酸对PRRSV和PCV2的免疫增强作用，通过细菌脂质体、核酸和菌体蛋白组合优化，设计出水溶性复合免疫佐剂，明确了其对PCV2灭活抗原和Cap重组蛋白均具有较强免疫佐剂作用，佐剂免疫效果优于从法国进口的免疫免疫佐剂。配置的水佐剂疫苗免疫效果优于进口PCV2 Cap亚单位疫苗，从而填补了我国猪用水性免疫佐剂的空白。
细胞悬浮培养技术是生物疫苗规模化生产的必经之路。课题组通过昆虫细胞培养条件优化，建立了两级生物反应器悬浮细胞培养工艺。27~28℃下培养96小时，细胞数达4~6×106/mL。优化了最佳的无血清细胞生长液、生物反应器搅拌速度、溶氧量和酸碱度等工艺参数。接种PCV2重组杆状病毒OKM株，培养一定时间后收获细胞，经过裂解处理后去除细胞碎片，纯化获得重组蛋白VLPs抗原。蛋白表达量高达100μg/ml，纯度达85%，制备的疫苗安全稳定，一针注射，免疫保护效力100%，免疫期5个月，疫苗技术参数超过进口同类疫苗，进一步创新并提高了PCV2基因工程疫苗关键技术，2021年10月获得新兽药注册证书，目前已经实现产业化生产。
猪圆环病毒2型合成肽疫苗——引领兽药行业技术发展
疫苗抗原设计和制造是疫苗研制的关键核心内容。病毒疫苗抗原制备路径包括细胞培养、病毒培养和生化合成。随着生化合成技术的发现，小分子生物药物逐渐走入人们的视野。合成肽疫苗虽然具有抗原纯度高、无杂质及毒素、易大规模合成、生产成本低和无生物安全风险等独特优势，但产业化难题大，动物疫苗中仅有口蹄疫合成肽疫苗的成功例子。鉴于当初PCV2培养困难、免疫保护抗原基因工程表达技术不够成熟，课题组勇于突破，研制了PCV2单克隆抗体，揭示了Cap蛋白重要抗原表位。采用分子信息方法设计合成了数十条T、B细胞表位多肽，通过化学合成和动物免疫试验，发现两条合成肽疫苗免疫后可诱导猪体产生病毒特异的中和抗体，而且免疫动物淋巴细胞增殖应答及IL-4和IFN-γ细胞因子显著提高，能够显著降低PCV2野毒攻击，免疫仔猪的相对日增重明显提高，病毒血症和淋巴结病毒载量也明显降低。
在此基础上，课题组进一步发明了PCV2抗原肽Fmoc固相合成技术，攻克了目标多肽中10个氨基酸位点缩合关键技术难题，获得两条合成肽抗原。合成肽抗原的纯度均达85%，蛋白浓度达5.0-9.0mg/ml。疫苗抗原生产工艺简便快速，可摆脱病毒细胞培养工艺，提高疫苗抗原规模化生产效力。将合成肽抗原与油佐剂乳化，制备成油包水型疫苗，创制出世界首个猪圆环病毒合成肽疫苗。疫苗安全有效，疫苗技术参数达到国内外商品化的猪圆环病毒病疫苗免疫效力水平，获得一类新兽药注册证书，为该病防控提供了又一种重要手段。
为了确保疫苗生产质量控制和免疫效果评估，在姜平教授的带领下，课题组采用研制的PCV2 Cap重组蛋白及其单克隆抗体，建立了PCV2阻断ELISA抗体检测方法。该方法准确快速，可用于排除普遍存在于猪群中PCV1抗体的交叉干扰，为该病疫苗质量评估提供了可靠方法和检测试剂，成为国家技术标准。PCV2阻断ELISA抗体检测试剂盒获得新兽药注册证书。与此同时，课题组合作研制了猪圆环病毒2型水佐剂灭活疫苗、猪圆环病毒2型与副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体二联灭活疫苗获新兽药注册证书，并且都实现了产业化生产。研究制定的规模化猪场猪圆环病毒病综合防控技术规范获得江苏省地方标准。
姜平教授团队研制的猪圆环病毒病系列疫苗，从不同技术层面有效突破了防控该病发生的关键技术瓶颈，疫苗技术转让至中牧实业股份有限公司、普莱柯生物工程股份有限公司、乾元浩生物股份有限公司和申联生物医药(上海)股份有限公司等10家疫苗企业，疫苗全国推广使用，实现了我国对该病的有效防控，产生了显著社会、经济和生态效益，为我国猪圆环病毒病的防控作出了重要贡献。该研究成果对促进我国动物疫苗行业发展、提高生猪产业养殖水平和保障食品安全健康具有重要意义。
